组培技术：一般污染问题分析

组培室的污染来源一般可分为以下几方面：接种前污染、接种时污染、接种后污染、母本带菌。

一、接种前污染：培养基消毒不彻底

1、现象

培养基消毒不彻底，污染一般呈碟状出现在培养基内部，但也有在培养基表面或者瓶壁、瓶盖表面出现的。

2、原因

原因可能是由于灭菌锅加热不均匀，培养基量太多，瓶子没洗干净等。

3、应对

取若干批次培养基放置1～2周，观察污染出现情况，即可对灭菌成功率做出合适的评价。将培养基放置1周左右再用，可以实时监控灭菌成功率的同时具备较大的使用缓冲时间，以应对灭菌锅失效等突发情况。

二、接种时污染：员工操作或者相关除菌设备失效

1、现象

接种时带来污染，污染物一般贴着培养物生长，但少数情况下污染物也可能随机散布在培养基表面。

2、原因

这方面的原因包括员工操作不符合无菌操作要求，超净工作台高效过滤器失效，超净工作台风速过低，超净工作台表面没做好消毒，接种器具消毒不彻底。组培工厂一般员工的污染率通常在3%左右，而由技术员进行严格的接种操作时，污染率可控制到1%以下。如果一个组培工厂接种人员之间的污染率差异巨大，就应该在“接种时污染”这个方面去着手，寻求解决办法。

3、应对

应对的措施一般有定期检测机台过滤效果，检测机台气流大小，规范员工操作，检测高温消毒器，检测铁盘或者纸片的消毒效果。

三、接种后污染：培养过程中，由气流或小动物带来污染

1、现象

污染物一般散布在培养基表面，而不是贴着培养物生长。有时由小动物如螨虫或者蓟马带入时，还能在瓶内看到微小的爬动的虫子，这时的菌类污染物可能从瓶盖或者瓶壁向下生长，也可能在培养基表面长出弯弯曲曲的轨迹（沿着虫子爬行的足迹生长），螨虫污染的情况下，能观察到瓶壁有蛛网状细丝。

2、原因

原因可能是培养间洁净度较差，气流较快，使灰尘飘动较多；缓冲不良使蓟马飞入；培养间人员衣着不规范带来较多螨虫；或者没有对污染进行定期的监控，使虫子带来的污染有扩散的机会。

3、应对

首先应该分清污染源。如果发现污染有在瓶间扩散的迹象，最可能是虫子带来的污染。应即刻拧紧污染瓶盖并清除污染瓶。平时应注意培养间的缓冲区效果，规范员工衣着，定期清洁培养间，如每周拖两次地。培养间内可设置每晚臭氧消毒。最有效的措施还是定期检查并清除污染。

4、关于螨虫污染

这里再补充一下个人看法。在一般洁净程度的培养环境下，螨虫会随机出现。毕竟人体就带有螨虫。

观察到螨虫污染时，有更多未观察到的母瓶已经被污染。因为螨虫从瓶口爬到培养基上，在真菌菌落长出前这个阶段不能被观察到。当1筐材料有较多污染时应立即整筐丢弃。

有螨虫在瓶口螺旋内未能进入瓶内，这样的母瓶在转瓶前一直是洁净的，在转瓶后会爆发污染。

可能有少量不带霉菌孢子的螨虫进入瓶内，因而不能被观察到。这样的母瓶会被忽视并成为隐藏的传染源。当螨虫在瓶内大量繁殖，在瓶口进进出出，最终会出现真菌污染。

为控制螨虫污染，筛查是最主要措施，打药效果并不明确。筛查操作应该每3～7天一次，坚持到整个培养间的螨虫污染率降到0.1%以下。然后每周全面清理霉菌污染，直到未发现疑似螨虫污染。

遇到螨虫爆发，往往是平时管理不善。这时看到明显污染的只是一部分，更多的瓶子已经有螨虫但未能被轻易观察到。因此发现螨虫爆发后即使立即清理污染瓶，后续还是会出现污染持续增多的现象。配合着坚持筛查，污染量出现高峰后会逐渐下降，而整个“螨虫病程”估计将持续2～3个培养周期。应对措施良好的情况下，3个周期后应该能将螨虫量控制到正常的水平，但此后也应该有持续的监控措施。

四、母本带菌：组培物本身有内生菌，或外植体消毒时保留了轻微带菌的材料

1、现象

这类污染必然紧贴着培养物表面开始出现的。这类污染既然能被保留下来，进行带菌组培，一般生长较缓慢，在培养基内呈较难观察到丝状。但随着培养代数增加，污染物的生长速度也可能变快，污染变明显（原因可能是经过较长时间细菌出现了快速生长的变异，然后占据了生长优势）。

2、原因

一般植物体内都或多或少地有内生菌。轻微的污染不易被察觉，也不太影响培养物的生长，易被保留。

3、应对

对于有内生菌问题，那就尝试使用没有内生菌的材料，包括茎尖脱毒处理等。同一批母本得到的培养物，也可能有少部分不含内生菌的材料，仔细挑选着部分材料进行扩繁，其余的也可利用几代。如果内生菌一直不影响组培物生长，也可以无视。

对于轻微污染的情况，应该在一开始就尽可能仔细地挑选出无菌材料进行重点扩繁。当然，合适的接种操作也可以将轻微污染一直控制在可控的范围，如每次转瓶时都切除所有老组织，只用新的组织进行扩繁或出苗。